Introduzione

La steatosi epatica non-alcol correlata è una condizione clinico-patologica caratterizzata da accumulo di grasso nelle cellule parenchimali del fegato; essa comprende un ampio spettro di quadri istologici quali la steatosi, la steatoepatite (NASH, Non-Alcolic Steatohepatitis) e la cirrosi^1, 2. I meccanismi fisiopatologici alla base dello sviluppo e della progressione della NAFLD sono complessi e non ancora completamente chiariti. Negli ultimi anni è stata sempre più avvalorata la teoria della “multiple parallel hits hypothesis”³. Secondo questa teoria, l’accumulo iniziale di trigliceridi nel fegato (first hit) renderebbe l’organo più sensibile a diversi altri fattori, responsabili, quindi, dell’infiammazione e del danno epatico³. Dati sperimentali suggeriscono che, tra questi fattori, l’infiammazione e la conseguente disfunzione del tessuto adiposo (TA) possano svolgere un ruolo cruciale^4, 5. L’infiammazione del TA è una condizione patologica complessa, dovuta ad eccessivo introito calorico e al conseguente accumulo di acidi grassi. Le caratteristiche anatomopatologiche riscontrate in questa condizione sono l’ipertrofia degli adipociti, le alterazioni del compartimento stromale, l’infiltrazione macrofagica, l’espressione di citochine pro-infiammatorie, l’ipossia e la morte adipocitaria, l’eccessiva deposizione di collagene^6-9. Queste modificazioni conducono ad una riduzione progressiva della funzionalità dell’organo e provocano l’instaurarsi di uno stato pro-infiammatorio sistemico^10-12. Inoltre, l’evoluzione dell’infiammazione del TA verso la fibrosi limita la capacità dell’organo di immagazzinare lipidi e causa un aumento degli acidi grassi liberi in circolo, promuovendo così l’accumulo di questi in organi ectopici, come il fegato^{4, 5, 13, 14}. Per questo motivo sembra che il TA disfunzionale possa rappresentare il primum movens per lo sviluppo della steatosi epatica non alcolica (NAFLD, non-alcoholic fatty liver disease) e possa anche promuoverne l’evoluzione. In particolare, questa associazione è stata dimostrata da Duval e collaboratori che hanno studiato lo sviluppo di NAFLD in topi sottoposti ad una dieta ipercalorica per 21 settimane. Nei modelli murini, alla diagnosi di NAFLD si associavano alterazioni morfologiche del TA epididimale, come le cosiddette “crown-like structures” costituite da adipociti atrofici circondati da cellule infiammatorie¹⁵.

Sulla base di queste premesse, lo scopo di questo studio è stato quello di indagare le alterazioni morfologiche, immunoistochimiche e di espressione genica del TA in relazione alla presenza di NAFLD in soggetti adulti obesi.

Materiali e metodi

Popolazione

Per questo studio sono stati reclutati 40 soggetti obesi tra quelli afferenti presso il Day Hospital di Endocrinologia, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sapienza Università di Roma, per eseguire le valutazioni cliniche precedenti all’intervento di chirurgia bariatrica.

Il protocollo di studio è stato valutato e approvato dal Comitato Etico locale e lo studio è stato condotto in conformità con le procedure delineate nella Dichiarazione di Helsinki. La firma del consenso informato da parte di tutti i partecipanti ha preceduto l’arruolamento nello studio.

Per essere eleggibili, i pazienti dovevano soddisfare i seguenti criteri di inclusione: sesso maschile o femminile, etnia caucasica, età compresa tra 18 e 65 anni, Body Mass Index (BMI) > 35 kg/m², assenza di storia attuale o passata di eccessiva assunzione di alcol definita come consumo quotidiano > 30 grammi/die nell’uomo e > 20 grammi/die nella donna, negatività sierologica per presenza di antigene di superficie dell’epatite B e anticorpi per epatite C, assenza di storia o elementi clinici compatibili con diagnosi di cirrosi epatica, insufficienza epatica cronica, insufficienza renale, scompenso cardiaco, cancro e patologie psichiatriche.

Analisi cliniche e di laboratorio

Tutti i partecipanti sono stati sottoposti a work-up clinico comprensivo di esame obiettivo, misurazioni antropometriche e indagini di laboratorio. Peso ed altezza sono stati misurati indossando abiti leggeri e senza scarpe. Il BMI è stato calcolato come peso in kg diviso per il quadrato dell’altezza in metri (kg/m²). La circonferenza vita (cm) è stata misurata nel punto di mezzo tra la 12a costa e la cresta iliaca. La pressione arteriosa sistemica (sistolica, PAS; diastolica, PAD; mmHg) è stata misurata dopo cinque minuti di riposo attraverso strumento elettronico provvisto di bracciale della misura appropriata alla circonferenza del braccio del paziente, con l’arto superiore collocato all’altezza del cuore. Sono state eseguite, quindi, tre misurazioni consecutive ed è stata riportata la media della seconda e terza misurazione ai fini delle analisi statistiche.

L’intera popolazione è stata sottoposta a prelievo venoso a digiuno per la misurazione dei valori sierici di glucosio (mg/dl), emoglobina glicosilata (HbA1c, %), colesterolo totale (mg/dl), colesterolo HDL (HDL, mg/dl), trigliceridi (mg/dl), aspartato aminotransferasi (AST, IU/l) e alanina aminotransferasi (ALT, IU/l) attraverso metodiche di laboratorio standardizzate.

I livelli di colesterolo LDL (LDL, mg/dl) sono stati calcolati applicando la formula di Friedwald.

I pazienti con glicemia a digiuno < 126 mg/dl sono stati sottoposti a curva da carico orale standard con 75 gr di glucosio (OGTT) e prelievi per misurazione della glicemia e dell’insulinemia ai tempi 0’, 30’, 60’, 90’, 120’ minuti dall’ingestione del glucosio.

Il grado di IR e quello di secrezione insulinica sono stati stimati attraverso calcolo degli indici statici e dinamici HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance)¹⁶, HOMA-β%¹⁶ e QUICKI¹⁶.

Biopsia e istologia epatica e del tessuto adiposo 

Tutta la popolazione di studio si è sottoposta ad intervento di chirurgia bariatrica con procedura di sleeve-gastrectomy.

Durante la seduta operatoria sono state eseguite biopsia epatica e di TA viscerale. I frammenti di fegato e TA sono stati prelevati, fissati in formalina durante la notte, inclusi in paraffina ed infine sezionati. La lettura delle slide è stata eseguita da un unico patologo esperto blinded per l'identità, la storia clinica e i parametri biochimici dei pazienti.

Per il tessuto epatico, è stata richiesta una lunghezza minima del campione bioptico di 15 mm o almeno la presenza di 10 spazi portali completi. Per l’istologia del fegato sono state ottenute sezioni di 3-4 μm per colorazione con Ematossilina/Eosina e tricromica di Masson. La NASH è stata diagnosticata in base ai criteri di Brunt¹⁷ ed è stato inoltre calcolato il NAFLD activity score (NAS).

Lo studio istochimico e la deposizione di fibre collagene nel TA sono stati eseguiti con fast green FCF/Sirius. L’infiltrazione macrofagica è stata quantificata attraverso valutazione immunoistochimica dell’espressione nucleare del CD68 in relazione al numero totale dei nuclei (1:100, M0876; Dako) e le modificazioni nella densità micro-vascolare con la valutazione del CD34 (clone QBEnd/10; Leyca Biosystem, Newcastle, UK). Un doppio immunostaining ha permesso di identificare contemporaneamente la presenza di cellule adipocitarie apoptotiche (TUNEL assay) sul totale degli adipociti (Perilipin, ab3526; Abcam). Le cellule apoptotiche sono state identificate con kit Apoptag plus peroxidase In Situ Apoptosis Detection (Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Le biopsie di TA sono state poi classificate in base alla presenza e severità di danno infiammatorio, consistente in infiltrazione e attivazione macrofagica, apoptosi adipocitaria e fibrosi. Per approfondire lo studio dell’infiammazione nel TA sono state eseguite specifiche colorazioni immunoistochimiche con anticorpi vs Neutrin-1 (1:200, AF1109; R&D Systems), Caveolin-1 (1:500, 610059; BD Biosciences), UNC5B (1:200, ab54430; Abcam), IL-8 (1:100, LS-B2809, LS Bio IL-1b), MIP-1α (1:150, clone 3E1, LS-C174781, LS Bio), MIP-2 ( 1:100, aa34-107, LS-C294368, LS Bio) e TIMP1 (1:100,  aa157-188IHC-plus, LS-B10535, LS Bio).

Biologia molecolare

Nel TA è stata inoltre valutata l’espressione mRNA di un ampio pattern di molecole immuno-infiammatorie (WISP1, GrB, Neutrin1, UNC5B, Caveolin1, IL8, MIP-1α, MIP-2, TIMP1, Caspase3, Caspase7, PARP1, HIF-1α).

Analisi statistica

Tutte le analisi sono state eseguite impiegando il software statistico SPSS versione 23. I valori sono riportati nel testo e nelle tabelle come media ± deviazione standard (SD) per le variabili continue e come percentuale per le variabili categoriche. I confronti tra due gruppi sono stati eseguiti attraverso l’impiego del test T di Student per le variabili continue e test χ² per le variabili categoriche. Le variabili non distribuite normalmente sono state sottoposte a trasformazione logaritmica naturale. La significatività delle correlazioni bivariate è stata valutata attraverso calcolo del coefficiente di Spearman o attraverso correlazioni parziali aggiustate per età e sesso. Un valore di p < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Le caratteristiche cliniche e biochimiche della popolazione sono riportate nella Tab. 1. Dei 40 soggetti partecipanti allo studio sottoposti a chirurgia bariatrica, il 75% è risultato affetto da NAFLD, in particolare il 50% da steatosi epatica semplice e il 25% da NASH, mentre il restante 25% non evidenziava danno epatico. Le caratteristiche cliniche e biochimiche della popolazione in relazione alla presenza o assenza di NAFLD sono illustrate nella Tab. 2.

I pazienti affetti da NAFLD differivano significativamente dai soggetti senza NAFLD per diversi parametri tra cui: BMI (43 ± 9.5 vs 47.3 ± 5.4 kg/m², p=0.02), trigliceridi (133.1 ± 44.6 vs 96.9 ± 22.3 mg/dl, p=0.03), glicemia (101.8 ± 17.3 vs 92.5 ± 4.1 mg/dl, p=0.02),  HbA1c (7.4 ± 1.47 vs 5.8 ± 0.8%, p=0.004), HOMA-IR (3.61 ± 2.1 vs 1.75 ± 0.9, p=0.01), HOMA-β (170.28 ± 41.6 vs 95.98 ± 34.3 %, p=0.02) e  ALT (33 ± 15.8 vs 17 ± 38 IU/l, p=0.009). Nei soggetti con diagnosi istologica di NAFLD la prevalenza di SM era significativamente maggiore rispetto ai soggetti sani (p=0.02) (Tab. 2).

I pazienti con NAFLD presentavano inoltre una maggiore severità del danno infiammatorio del TA all’istologia rispetto alla sottopopolazione senza NAFLD. In particolare la diagnosi di NAFLD si associava ad incrementata presenza di macrofagi CD68⁺ (r=0.33, p=0.04, Fig. 1), riduzione della densità microvascolare (r=-0.42, p=0.03) e aumentata fibrosi (r=0.38, p=0.04). La NAFLD si associava anche all’espressione nel TA di numerosi marcatori di stress, infiammazione e fibrosi tissutale come UNC5B (r=0.58, p=0.02), CASP7 (r=0.4, p=0.01), HIF1-α (r=0.43, p=0.02), IL-8 (r=0.4, p=0.03), MIP2 (r=0.4, p=0.03), WISP-1(r=0.35, p=0.04) e  GrB (r=0.3, p=0.04) (Tab. 3).

 

Parametri	Soggetti obesi n=40
Età	43.7 ± 9.6
Sesso (M/F)	10/30
BMI (kg/m2)	43.6 ± 5.6
Circonferenza vita (cm)	128 ± 11.4
PAS (mmHg)	128.3 ± 16.1
PAD (mmHg)	84.8 ± 18.2
Colesterolo totale (mg/dl)	200.8 ± 29
HDL-C (mg/dl)	48.3 ± 9.8
LDL-C (mg/dl)	126.3 ± 25
Trigliceridi (mg/dl)	124 ± 42.9
Glicemia (mg/dl)	98.4 ± 29.3
HbA1c (%)	6.59 ± 2.1
HOMA-IR	4.59 ± 2.9
HOMA-β%	163.69 ± 82.1
QUICKI	0.32 ± 0.11
AST (IU/l)	22.9 ± 9.8
ALT (IU/l)	28.8 ± 15.4
Sindrome metabolica (%)	80%, 32
Diabete (%, n)	15%, 6

 Tab. 1: Caratteristiche cliniche e biochimiche della popolazione

 

Parametri	Non NAFLD (n=10)	NAFLD (n=30)	P-value
Età (anni)	44.9 ± 9.5	43 ± 9.5	0.62
Sesso (M/F)	0/10	10/20	0.058*
BMI (kg/m2)	47.3 ± 5.4	43 ± 9.5	0.02
Circonferenza vita (cm)	128 ± 15.5	128 ± 7.7	0.99
PAS (mmHg)	129.2 ± 12	125.1 ± 11.3	0.44
PAD (mmHg)	83.3 ± 8.7	86.2 ± 22.5	0.76
Colesterolo totale (mg/dl)	213.1 ± 33	196.7 ± 27.1	0.17
HDL-C (mg/dl)	51.6 ± 8.8	47.2 ± 10	0.28
LDL-C (mg/dl)	141.7 ± 26.7	121.2 ± 22.8	0.08
Trigliceridi (mg/dl)	96.9 ± 22.3	133.1 ± 44.6	0.03
Glicemia (mg/dl)	92.5 ± 4.1	101.8 ±17.3	0.02
HbA1c (%)	5.8 ± 0.8	7.4 ± 1.47	0.004
HOMA-IR	1.75 ± 0.9	3.61 ±2.1	0.01
HOMA-β%	95.98 ± 34.3	170.28 ± 41.6	0.02
QUICKI	0.31 ± 0.18	0.33 ± 0.11	0.4
AST (IU/l)	18.7 ± 5.9	24.4 ± 10.5	0.07
ALT (IU/l)	17± 38	33 ± 15.8	0.009
Sindrome metabolica	10%, 1	53%, 16	0.02*
Diabete (%, n)	0%, 0	20%, 6	0.15*

Tab. 2: Caratteristiche cliniche e biochimiche dei pazienti in relazione alla presenza o meno di NAFLD

*Chi-Quadro (χ²)

 

	Coefficiente di Spearman	p-value
Presenza di macrofagi CD68+ nel TA	0.33	0.04
Densità microvascolare nel TA	-0.42	0.03
Fibrosi nel TA	0.38	0.04
Espressione di UNC5B nel TA	0.58	0.02
Espressione di CASP7 nel TA	0.4	0.01
Espressione di HIF1-α nel TA	0.43	0.02
Espressione di IL-8 nel TA	0.4	0.03
Espressione di MIP-2 nel TA	0.4	0.03
Espressione di WISP-1 nel TA	0.35	0.04
Espressione di GrB nel TA	0.3	0.04

Tab. 3: Correlazioni bivariate della diagnosi istologica di NAFLD

 

Fig. 1: Infiltrazione macrofagica CD68+ in tessuto adiposo viscerale

Discussione

Questo studio dimostra che, in soggetti obesi, la diagnosi istologica di NAFLD si associa strettamente con i parametri morfologici, immunoistochimici e di espressione genica di disfunzione del TA.

Tale associazione è stata precedentemente dimostrata in modelli murini di NAFLD il cui pannicolo adiposo epididimale presentava adipociti atrofici circondati da cellule infiammatorie, prevalentemente macrofagi, e fibrosi¹⁵. Successivamente, Du Plessis e colleghi hanno dimostrato l’associazione tra l’infiltrazione macrofagica del TA e l’espressione di geni pro-infiammatori nel TA viscerale e sottocutaneo in soggetti con NAFLD¹⁴.

I nostri dati mostrano che la NAFLD oltre ad essere associata con un quadro morfologico caratteristico di infiammazione del TA è anche strettamente correlata con l’espressione adipocitaria di specifici marcatori di stress (CASP7, HIF1-α), infiammazione (UNC5B, IL-8, MIP2 e WISP-1) e fibrosi (GrB) del tessuto.

L’infiltrazione di macrofagi CD68⁺ nel TA dimostrava la presenza di infiammazione e disfunzione dell’organo ed è stata precedentemente associata, in modelli murini, all’infiltrazione macrofagica nel fegato durante lo sviluppo di NAFLD, a dimostrazione della presenza di un cross-talk tra questi due organi, in corso di infiammazione^{10-12, 18, 19}. In linea con ciò, la NAFLD si associava anche all’espressione di molecole che mediano l’infiltrazione macrofagica come UNC5B e MIP2. UNC5B, infatti, stimola la ritenzione macrofagica nel TA, in risposta a neutrin-1, prodotta in condizione di aumentato accumulo di grassi^{18, 20}; MIP-2, invece, induce l’adesione endoteliale di cellule immunitarie nel TA, contribuendo all’infiammazione²¹.

La diagnosi di NAFLD si associava, poi, con l’espressione nel TA di IL-8, citochina prodotta da adipociti e cellule infiammatorie nel TA in condizione di obesità, mediatrice dell’infiammazione locale e sistemica e dell’insulino-resistenza d’organo^{22, 23}. Inoltre, per la prima volta negli uomini, abbiamo dimostrato l’espressione adipocitaria di WISP1, una nuova adipochina che inibisce la differenziazione degli adipociti e induce pathways infiammatori; nella nostra popolazione, la sua espressione correlava con la presenza di NAFLD^{24, 25}.

Ancora, la NAFLD si associava all’espressione di HIF-1α, riconosciuto mediatore del segnale ipossico, e di CASP7, enzima della cascata apoptica^{26, 27}. L’ipossia partecipa alla disfunzione del TA inibendo la differenziazione degli adipociti e inducendo la polarizzazione dei macrofagi in senso pro-infiammatorio, mentre l’apoptosi riduce la riserva adipocitaria del TA, limitandone la funzionalità globale^{27, 28}. Questa condizione di ipossia e apoptosi cellulare è legata sia all’infiammazione sia all’alterata vascolarizzazione del TA, che, in queste condizioni, perde la sua normale densità vascolare²⁹. Infatti, l’ipertrofia degli adipociti non è accompagnata da una parallela e funzionale vasculogenesi, probabilmente a causa di un perduto controllo nella regolazione dei fattori angiogenici e angiostatici^{27, 30}. Nella nostra analisi, una ridotta densità microvascolare, caratteristica di un TA disfunzionale, correlava con la presenza di NAFLD.

Infine, abbiamo dimostrato, per la prima volta nell’uomo, l’espressione nel TA di GrB, una proteasi prodotta dai macrofagi infiltranti che causa morte cellulare, produzione di citochine infiammatorie, alterata permeabilità vascolare e rimodellamento della matrice extracellulare, partecipando quindi all’infiammazione e alla fibrosi del TA^31-34. I livelli di GrB e la fibrosi del TA, valutata allo studio istologico, correlavano tra loro e con la diagnosi di NAFLD.

In conclusione, questo studio dimostra che nei soggetti obesi esiste una stretta associazione tra diagnosi istologica di NAFLD e presenza di disfunzione del tessuto adiposo evidenziata da alterazioni morfologiche, immunoistochimiche e di espressione genica indicative di una condizione di infiammazione, ipossia e fibrosi.

Questi dati forniscono le basi per futuri studi volti ad approfondire il nesso di causalità tra la disfunzione del TA e lo sviluppo di NAFLD in soggetti obesi, ad indagare i meccanismi alla base di tale rapporto e identificare nuove strategie di prevenzione e terapia.