Introduzione

Il colangiocarcinoma (CCA) è una delle neoplasie più aggressive con prognosi peggiore a livello mondiale. Attualmente il solo trattamento in grado di fornire un potenziale beneficio è dato dalla chirurgia, sebbene solo una minoranza dei pazienti sia operabile alla diagnosi¹. Data l’assenza di trattamenti efficaci, è necessario comprendere i meccanismi patogenetici della malattia, in modo da individuare nuovi potenziali targets terapeutici, identificabili tra i markers specifici espressi dal tessuto neoplastico.

Reelin è una glicoproteina secreta a livello extracellulare da una varietà di tessuti a livello embrionale e nell’adulto². Nel tessuto nervoso embrionale, è dimostrato essere necessaria per una migrazione cellulare regolata e per il mantenimento del corretto orientamento neuronale³. Topi Reeler knock-out per entrambi i recettori di Reelin sviluppano atassia, ipoplasia del cervelletto e disposizione erronea delle cellule nervose⁴; analogamente mutazioni nel gene umano di Reelin (RELN) sono associate alla lissencefalia autosomica recessiva con ipoplasia cerebellare⁵. Reelin agisce primariamente come segnale di stop nella migrazione delle cellule neuronali⁶: diversi studi riportano un suo ruolo nella modulazione dell’adesione intercellulare mediata da alpha3beta1 integrina⁷ e da N-caderina⁸; recenti evidenze suggeriscono un suo coinvolgimento nella stabilizzazione del citoscheletro nel processo di migrazione neuronale⁹. Nel cervello adulto, tale proteina rimane attiva, essendo coinvolta nei pathway di segnale che garantiscono la neurotrasmissione, i processi di memorizzazione e la plasticità sinaptica¹⁰. Dati recenti hanno dimostrato che Reelin è espressa anche in tessuti adulti periferici, quali sistema nervoso periferico¹¹, fegato¹², rene, testicolo e ovaio murini¹³, retina, tube di Falloppio, mammella¹⁴, negli odontoblasti¹⁵, nonché a livello delle cellule cromaffini del surrene, delle cellule MSH-secernenti della pars intermedia dell’ipofisi¹⁶ e a livello del pancreas¹⁷. Per analogia con il tessuto nervoso, tale marcatore potrebbe svolgere un ruolo nel mantenimento strutturale degli organi periferici in cui è espresso.

Reelin è stata recentemente studiata in diverse patologie tumorali a livello di diversi organi, quali fegato¹⁸, esofago¹⁹, mammella²⁰, stomaco²¹, colon²² e pancreas¹⁷, nelle quali è soggetta ad una down-regulation. Per i tumori dello stomaco e della mammella, la ridotta espressione di Reelin è stata associata rispettivamente ad uno stadio più avanzato di malattia e a peggior prognosi. Non vi sono attualmente dati circa la sua espressione nel colangiocarcinoma.

Diversi studi hanno correlato la ridotta espressione di Reelin a meccanismi epigenetici legati all’ipermetilazione del suo promotore^20-24. La regolazione epigenetica consiste in cambiamenti ereditabili nell’espressione genica che si verificano indipendentemente da cambiamenti nella sequenza primaria di DNA; tali modificazioni si verificano a livello del DNA e delle proteine istoniche, regolando l’accessibilità della cromatina e, conseguentemente, l’espressione genica.

Alterazioni in queste modificazioni sono un hallmark del cancro; terapie epigenetiche tentano di normalizzare i pattern di metilazione del DNA e le modificazioni post-traslazionali degli istoni che promuovono o mantengono un fenotipo tumorale²⁵.

Il fattore epigenetico che è stato maggiormente correlato con la regolazione di Reelin è DNMT1²⁶, il quale, interagendo con UHRF1 e EHMT2(G9a), media il mantenimento dei marcatori di silenziamento trascrizionale dopo la replicazione del DNA. La replicazione del DNA porta a due filamenti di DNA figli emi-metilati. UHRF1 riconosce il DNA emi-metilato e recluta DNMT1 per ristabilire il pattern di metilazione sul DNA di nuova sintesi²⁷. L’interazione di DNMT1 con EHMT2 ristabilisce le modificazioni post-traslazionali degli istoni nuovamente depositati.

Obiettivi

Si tratta di uno studio preliminare il cui scopo è quello di indagare, tramite immunoistochimica (IHC), l’espressione di Reelin nel colangiocarcinoma intra- ed extraepatico rispetto al tessuto sano e di analizzare l’espressione di marcatori epigenetici implicati nel mantenimento della metilazione del DNA e degli istoni durante la replicazione, quali DNMT1, EHMT2 e UHRF1, nel tessuto tumorale e nel tessuto sano. Infine ci si è proposti di valutare la presenza di una eventuale correlazione tra i marcatori epigenetici analizzati e Reelin.

Materiali e metodi

Abbiamo effettuato un’indagine immunoistochimica su 31 campioni di CCA, di cui 9 intraepatici e 22 extraepatici.

Sono stati impiegati i seguenti anticorpi: mouse monoclonal anti-Reelin antibody (MAB5366, Merck Millipore Darmstadt, Germany); rabbit monoclonal anti-DNMT1 antibody (ab188453, Abcam Cambridge, MA); rabbit monoclonal anti-EHMT2/G9A antibody (ab185050, Abcam Cambridge, MA); rabbit monoclonal anti-UHRF1 antibody (ab194236, Abcam Cambridge, MA).

L’immunoreattività è stata valutata mediante analisi semi-quantitativa da due operatori in maniera indipendente. Sono state valutate l’intensità di espressione di ciascun marcatore e la percentuale di cellule che mostrano immunoreattività, attribuendo uno Score da 0 a 3 per entrambi i parametri. Tali dati sono stati utilizzati per elaborare un IHC Score, dato dal prodotto tra il punteggio attribuito all’intensità del segnale e quello assegnato sulla base della percentuale di cellule positive.

L’analisi è stata effettuata in 3 campi di regioni corrispondenti ad ingrandimento a 10X per ciascun marcatore. Uno Score complessivo per ogni singolo campione è stato anche derivato come media dei valori.

Risultati

Abbiamo osservato una riduzione dell’espressione immunoistochimica di Reelinnel tumore rispetto al tessuto non tumorale (p<0,01). L’analisi dei marcatori epigenetici implicati nel mantenimento della metilazione del DNA ed istoni ha mostrato che l’espressione di DNMT1, EHMT2 e UHRF1 risulta significativamente aumentata nel tumore rispetto al tessuto sano (p<0.01) (Fig. 1).

L’IHC Score di Reelin risulta inversamente correlato con l’IHC Score di DNMT1 (R=-0,301; p<0,01) e quello di UHRF1 (R=-0,31; p=0,041). Al contrario non si individua una correlazione staticamente significativa tra Reeline EHMT2 (Tab. 1).

 

Fig. 1: Immunoistochimica per Reelin (prima colonna da sinistra), DNMT1 (seconda colonna), UHRF1 (terza colonna) e EHMT2 (quarta colonna): analisi per campi corrispondenti. Nelle immagini disposte nella riga inferiore si nota come, analizzando campi corrispondenti, l’immunoreattività citoplasmatica di Reelin risulti lieve o assente, mentre la positività nucleare di DNMT1, UHRF1 e EHMT2 sia intensa; nella riga superiore, viceversa, l’intensa positività citoplasmatica di Reelin correla inversamente con la positività lieve o nulla di DNMT1, UHRF1 e EHMT2.

 

Tab. 1: Sono indicati i valori di mediana tra gli IHC score dei marcatori analizzati. Tra parentesi sono riportati i rispettivi range interquartili 25-75%.

 

Nella valutazione campo per campo, l’IHC Score di Reelin risulta inversamente correlato con l’IHC Score di DNMT1 (Test di Spearman, R=-0,301; p<0,01) e quello di UHRF1 (Test di Spearman, R=-0,31; p=0,041). Al contrario non si individua una correlazione staticamente significativa tra Reeline EHMT2 (Test di Spearman, R=-0.088; p=0,49) (Fig. 2).

 

 

Fig. 2: Confronto (test U di Mann-Whitney) dell’espressione di Reelin, DMT1, EHMt2 e UHRF1 nel tessuto sano e nel colangiocarcinoma.

 

Discussione

Nel tessuto nervoso l’espressione di Reelin è dimostrato essere necessaria per il normale posizionamento dei neuroni; per analogia tale marcatore potrebbe svolgere una funzione analoga nei tessuti nei quali è stato riportato essere espresso.

Nella patologia tumorale, in cui si assiste a una disregolazione dei normali meccanismi di omeostasi cellulare e tissutale, la diminuzione dell’espressione di Reelin potrebbe essere associata ad un’alterazione dei meccanismi di proliferazione e migrazione, associati allo sviluppo neoplastico.

Sebbene siano necessari ulteriori studi che confermino tali dati, la ridotta espressione di Reelin osservata nel colangiocarcinoma rispetto al tessuto sano fa supporre un possibile coinvolgimento della proteina nei meccanismi tumorali del colangiocarcinoma.

L’osservazione di una correlazione inversa tra l’IHC Score di Reelin e l’IHC Score di DNMT1-UHRF1 suggerisce che il gene RELN possa essere regolato mediante variazioni del grado di metilazione del DNA, processo al quale DNMT1 e UHRF1 prendono attivamente parte. La possibile regolazione epigenetica del gene RELN potrebbe, se confermata, aprire nuovi scenari sul piano terapeutico, tenendo conto del carattere potenzialmente reversibile delle modificazioni epigenetiche e della disponibilità già attualmente di molecole in grado di inibire DNMT1 (Azacitabina, Decitabina)²⁷, UHRF1²⁸ o il complesso DNMT1-EHMT2 (CM-272)^{29, 30}.